表觀遺傳的高速公路CUT&Tag與ATAC-seq技術助力擬南芥細胞分化研究
Novoprotein 2022-06-22 13:09 發表於浙江
2022年5月11日，武漢大學孫蒙祥教授在《The Plant Cell》雜誌在線發表關於表觀遺傳調控決定擬南芥生殖細胞和營養細胞的不同命運相關研究文章。研究發現，H3K27me3是決定這兩種細胞不同命運的關鍵因素。
眾所周知，擬南芥這類被子植物的小孢子經過有絲分裂可以產生營養細胞（VC）和生殖細胞（MG Cells，MG cells包含GC和SC細胞，本文以SC細胞為研究對象）。先前的研究表明，VC和MG cells存在不同的基因表達模式，也有著不同的DNA甲基化模式，但是並沒有揭示VC和MG cells不同分化路徑的關係。本篇文獻利用CUT&Tag、ATAC-seq、RNA-seq等組學技術，並聯合細胞學揭示VC和MG cells的關係，即在MG cells發生了H3K27me3的擦除，而VC則繼承了小孢子H3K27me3。
在該項研究中，近岸蛋白CUT&Tag技術pA-Tn5轉座體（升級後為pAG-Tn5轉座體，貨號：M059）助力揭示H3K27me3在VC和MG cells中的不同修飾。
前期先前關於H3K27me3甲基化的研究引起孫蒙祥教授課題組的注意，既然H3K27me3可能是關鍵影響因素，那麼首先需要得要證明H3K27me3在VC和MG cells中是否真的存在差異。與此同時，也構建了H3K27me3擦除轉基因植株（REF-6介導的擦除，轉基因植株統一代號為TL），觀察野生型和轉基因植株中VC、MG cells的H3K27me3分佈差異。H3K27me3免疫熒光發現野生型植株VC細胞核（VN）中能夠檢測出信號，但是MG cells的SC細胞核（SN）不能檢測出信號，當然，TL植株中是無法檢測H3K27me3的免疫熒光信號的（圖1） 。這表明H3K27me3在VC和MG細胞中存在差異。
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圖1.野生型和TL轉基因植株VN、SN的H3K27me3免疫螢光檢測
既然H3K27me3在VC中被檢測出，那麼其是如何調控VC命運的呢？研究人員觀察了H3K27me3擦除植株TL的表型，結果發現花粉囊泡組織異常且無法形成、花粉管破裂、雄性生殖單位破壞，而雄性生殖單位常常被認為是功能性VC的重要標誌。
由此以上可知，H3K27me3存在於VC中並且對其功能特異性至關重要。但是，H3K27me3是如何調控VC、MG cells命運的呢？根據先前的研究發現，TL植株花粉粒表型與VC-異常DUO1基因表達株系的類似，VC中H3K27me3的擦除可能將其轉變為MG cells。為了證實這一點，研究員檢測了TL植株和野生型植株的VC細胞是否含有MG cells標誌物，結果在TL VC中檢測出MG cells標誌物HTR-10PFP，野生型植株VC中沒有檢測出（圖2 ）。另外，僅在在MG cells的SC中H3K9me2高度富集促進染色質縮合。研究院人員發現野生型植株SC細胞核（SN）和TL VC細胞核（VN）中H3K9me2富集度相似（圖2）。以上兩個實驗表明，VC中H3K27me3的擦除促進VC向MG cells轉變。
圖2.在野生型和TL植株VC細胞核（VN）、MG cells的SC細胞核（SN）中檢測HTR10-RFP標誌物和H3K9me2
研究人員進一步從染色質層面上探索H3K27me3對VC和MG cells命運的影響。利用CUT&Tag技術在WT VCs中獲取6950個H3K27me3 Peak，WT SCs中獲取694個H3K27me3 Peak，TL VCs獲取141個H3K27me3 Peak。即TL VCs的H3K27me3的分佈狀態與WT SCs的類似，且TL VCs發生了染色質層面上的變化。隨後，研究員利用ATAC-seq技術探索染色質開放狀態的變化。ATAC-seq生信分析的數據表明，與VC-Peak相關的註釋基因在WT SCs、TL VCs中較少而WT VCs中較多。與此相對，與MG-Peak相關的註釋基因在WT SCs、TL VCs中較多而WT VCs中較少。同時也發現，與MG-Peak相關的註釋基因被H3K27me3廣泛地抑制。CUT&Tag和ATAC-seq分析都表明TL VCs和WT SCs的染色質狀態相似而與WT VCs染色質狀態差異較大，即VC中H3K27me3的擦除導致染色質重塑（圖3）。
圖3.野生型和TL植株VC、SC細胞染色質狀態的研究
染色質狀態的變化導致VC、MG cells各自的命運，那麼到底是哪些基因協助這一命運形成的呢？研究員隨後做了RNA-seq進行轉錄組分析，註釋了一系列與VC、MG cells形成相關的基因。結果發現，與WT VCs相比，TL VCs中與VC-Peak關聯的基因表達水平下調而與MG-Peak關聯的基因表達水平上調，即TL VCs的基因表達模式與MG cells的類似。qpcr熒光定量分析也證實這些註釋的基因在WT VCs、TL VCs、MG cells中的表達情況。
作者利用多種技術經過一些列實驗證實了H3K27me3對於VC的身份維持至關重要，一旦擦除H3K27me3將推動VC向MG cells轉變。
CUT&Tag技術是一種新興的DNA-蛋白質互作研究方法，是用來取代傳統的ChIP-seq技術來探索組蛋白修飾區域、轉錄因子結合狀態以及全基因組範圍內DNA-蛋白質互作情況。2019年7月近岸蛋白質（Novoprotein）開發出CUT&Tag試劑盒，僅僅一個試劑盒就可以完成從靶蛋白結合DNA片段的獲取到測序文庫的構建。經過不斷的創新優化，CUT&Tag試劑盒已經從CUT&Tag 1.0、CUT&Tag 2.0迭代至CUT&Tag 3.0。CUT&Tag 3.0在原來基礎上進一步優化，提升轉座體的切割效率、配備實驗檢查體系、高效的小片段DNA提取磁珠等，以保證CUT&Tag實驗的高效進行。
與ChIP相比，CUT&Tag優勢清晰可見：
| Cat# | Product Name |
| N259-YH01 | NovoNGS ® CUT&Tag 3.0 High-Sensitivity Kit (for Illumina ® ) |
| M058-YH01 | NovoNGS ® ChiTag ® pAG-Transposase |
| M059-YH01 | NovoNGS ® ChiTag ® pAG-Transposome |
| N251 | NovoNGS ® Concanavalin A-coated Magnetic Beads |
| N253-YH01 | NovoNGS ® Digitonin (5%) |
| N269 | Goat Anti-Rabbit IgG H&L |
| N270 | Goat Anti-Mouse IgG H&L |
| N245 | Tagment DNA Extract Beads |
| N248 | ATAC-Seq實驗方案 |