手把手教會mRNA加帽率檢測探針設計及分子量預測
Novoprotein 2023-08-17 14:35 發表於浙江
完整的mRNA結構包括了5'端帽結構，兩端的非編碼區（UTR），中間蛋白質編碼區（ORF），以及3'端Poly(A)結構。mRNA的完整性確保了蛋白質的準確翻譯，5'-Cap帽結構修飾[1]可以保護mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促進翻譯的起始、降低mRNA自身免疫原性。按照GMP標準條件，每生產一批mRNA都需要對mRNA的加帽率等進行嚴格測定，mRNA加帽率檢測是mRNA品質控制的重要指標。
在真核細胞中，mRNA的加帽反應主要包括4步[2]：
1）RNA三磷酸腺苷酶催化新生mRNA 5'-三磷酸水解為5'-二磷酸結構；
2）鳥苷醯轉移酶將GMP轉移到5'-二磷酸結構中；
3）RNA甲基轉移酶對鳥嘌呤N7位點進行甲基化修飾，即產生Cap0帽子結構；
4）在mRNA第一位核苷酸的2'-羥基位被RNA甲基轉移酶進一步進行甲基化修飾即可產生Cap1帽子結構。
真核細胞mRNA加帽過程示意圖[2]
依據mRNA帽結構的引入過程，綜合RNase H的酶切特點，2016年諾華發表了基於RNase H酶切的加帽率檢測方法學文章。
Novoprotein累積檢測了上千個加帽率檢測案例，總結過程處理經驗，在原有的操作技術流程中引入了更為高效的探針設計方法，並開發免費線上工具，方便用戶快速完成探針設計及酶切產物分子量預測。
探針設計
根據目標樣品5’端序列，進行酶切探針設計。與傳統探針設計方法不同，Novoprotein依靠豐富的加帽率檢測經驗，優化探針設計原則，區別于傳統設計方案中RNA+DNA探針序列，將探針中DNA堿基設計在2'-O-甲基修飾的RNA堿基序列中間，形成RNA+DNA+RNA序列，既保證了探針結合，又減少了非特異性酶切的發生。
傳統探針設計方案酶切後結果：次裂解產物較多，非特異性酶切情況複雜，影響LC-MS結果分析。
Novoprotein探針設計方案酶切後結果：既保證了探針結合，又減少了非特異性酶切的發生，次裂解產物少，方便LC-MS結果分析。
綜合探針設計優化原則，Novoprotein特推出mRNA加帽率檢測配套系列免費線上工具，包括探針設計、反應體系計算、酶切產物分子量計算等模組，網址：https://www.novoprotein.com.cn/tool-class。註冊Novoprotein官網，擁有一個自己的專屬帳號，就可以輕鬆完成加帽率檢測準備工作。
第一模組：探針設計
mRNA序列從啟動子後第一個堿基開始輸入到序列框中，調節探針設計起點、探針長度以及RNase H預計酶切的位置及雜合鏈長度（推薦4個DNA堿基），將會在計算器的右側框中快速輸出對應的探針序列，根據探針序列的GC含量等微調左側輸入框內參數，即可獲得最終的探針序列。
第二模組：反應體系計算
該模組是基於NovoproteinmRNA加帽率檢測樣品處理試劑盒（目錄號：CD001）設計。該產品為磁珠法樣品處理完整試劑盒，涵蓋所有加帽率檢測樣品處理所需試劑，包括RNase H酶Mix、SA Beads、洗滌及稀釋buffer，另外配套陽性對照mRNA樣品及對應的生物素化探針，用戶只需要準備mRNA樣品即可。
試劑盒原理：
將探針與目標mRNA退火形成DNA/RNA雜交雙鏈後，引導RNase H在特定位置切割mRNA。再用鏈黴親和素磁珠捕獲與切割的片段配對的生物素標記的切割探針，將切割片段分離。最後更換溶劑條件，從探針中釋放結合的mRNA，含有裂解產物與探針的上清液用於LC-MS分析。
產品特點：
1）一步完成探針結合與酶切，操作簡便快速，全流程僅需1.5小時
2）特殊設計的裂解探針有效減少次裂解產物形成，便於後續加帽率檢測結果分析
3）可用於不同加帽工藝生產mRNA樣品處理
4）酶切mix穩定性強，37℃ 21天，反復凍融150次，酶切活性無影響
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在計算器左側介面輸入mRNA序列全長及樣本和探針濃度，即可在右側生產反應體系內各組分的加量。
第三模組：酶切產物分子量計算
如使用者是從第一模組探針設計開始使用該線上工具，那麼第一模組的資料將會自動傳輸到第三模組，使用者只需要選擇對應的堿基修飾方式及加帽方式，點擊計算，即可匯出該探針可能的所有酶切產物分子量。如使用者直接使用酶切產物分子量計算模組，輸入mRNA及探針序列後，同樣選擇對應的修飾堿基及加帽方式，即可匯出對應結果。
一款免費的線上工具，一站式完成mRNA加帽率檢測所有流程！降低了使用者序列轉換錯誤率，減少酶切產物等分子量計算工作量，極大地提高了工作效率。
參考文獻
[1] SHANMUGASUNDARAM M, SENTHILVELAN A, KORE A R. Recent Advances in Modified Cap Analogs: Synthesis, Biochemical Properties, and mRNA Based Vaccines [J]. Chem Rec, 2022: e202200005.
[2] MUTTACH F, MUTHMANN N, RENTMEISTER A. Synthetic mRNA capping [J]. Beilstein J Org Chem, 2017, 13: 2819-32.
[3] Label-free analysis of mRNA capping efficiency using RNase H probes and LC-MS [J]. Anal Bioanal Chem, 2016