多次跨膜蛋白「三大」開發策略，解決靶向膜蛋白藥物開發難的困境

多次跨膜蛋白「三大」開發策略，解決靶向膜蛋白藥物開發難的困境

Novoprotein  2023-07-19 20:04 發表於浙江

跨膜蛋白簡介
　　跨膜蛋白（TP），也稱為整合膜蛋白，佔膜蛋白總量的70%~80%。其主要特徵是不溶於水，其氨基酸組成疏水性強，也有親水性氨基酸，由疏水性氨基酸組成的部分，深入脂雙層的疏水區，與脂肪酸鏈共價結合，它們可分佈在脂雙分子層中或跨越全膜。跨膜蛋白在基本生理過程中起著重要作用，包括分子運輸、信號轉導和能量利用等。一方面，它們可用於向細胞傳遞外部環境的信號。另一方面，它們充當接收器收集有關外部環境信號。

跨膜蛋白分類
　　跨膜蛋白按功能可以分為多種類型，其中包括G蛋白偶聯受體（GPCR）、離子通道、轉運蛋白以及其他類型受體等。這些蛋白在細胞內發揮著不同的作用，例如在信號傳遞、物質轉運和細胞通訊等方面。GPCR的胞外區介導受體與配體相互作用，啟動的受體將信號傳遞到細胞內並招募下游效應蛋白。離子通道在細胞膜上形成一個孔道，疏水性氨基酸面向磷脂雙層，離子可以通過這個通道穿過細胞膜的疏水核心。這些跨膜蛋白雖然功能不同，但是在生物體中發揮著各自獨特和不可或缺的作用。

跨膜蛋白作為藥物靶點
　　跨膜蛋白是目前最主要的藥物靶點，佔現階段已知藥物靶點的60%以上，而針對抗體藥靶點，膜蛋白幾乎佔90%以上。以跨膜蛋白為靶點的創新藥研發一直是醫藥領域的研究熱點，其中離子通道、轉運蛋白、GPCR和激酶是藥物研發中最大的一類藥物靶點[1,2 ^]。它們參與調解許多重要的細胞生物學效應，其功能異常與多種疾病有關。因此，以它們為靶點開發的抗體在治療和預防相關疾病方面有獨特的優勢。
　　抗體靶向不同類型跨膜蛋白的作用機制不同^[3]，如下圖所示：（a）抗體啟動GPCR，作為配體活化或促二聚化；抗體抑制GPCR，如與配體競爭位點。（b）促進內化是抗體靶向離子通道的一種方式。（c）靶向特定功能狀態的特異性抗體，靶向細胞攝取葡萄糖的向內和向外開放狀態。（d）左側圖表示抗體針對MMP-14的結合部位，右側圖為通過穩定無活性的構象（如CD73二聚體）來抑制酶的活性。

圖1：選擇針對膜蛋白的抗體路徑^[3]

多次跨膜蛋白開發技術難點
　　抗原製備是研發抗體藥候選分子的首要條件，理想的抗原應該包含與靶蛋白功能相關的所有關鍵位點。因此，膜蛋白抗原需具有相關作用的完整構象和轉錄後修飾；然而跨膜蛋白的製備面臨著許多製約的瓶頸，包括膜蛋白表達量少，穩定性差，溶解度低及純化中遇到的問題。
•表達量低：相較於單次跨膜蛋白或分泌蛋白，多次跨膜蛋白通常表達量較低，需要嵌入細胞膜磷脂雙分子層中才能發揮其正常功能，而過表達的跨膜蛋白對細胞卻有損傷。
•純化困難：多次跨膜蛋白具有疏水結構域，在溶液中的溶解度往往較低，且容易形成聚集和失去活性，增加了跨膜蛋白提取和純化的難度。
• 結構複雜：多次跨膜蛋白的結構複雜，包含多個跨膜區域、環狀結構和糖基化修飾等，這些都增加了跨膜蛋白的製備難度。

近岸蛋白多次跨膜蛋白開發平臺
1. ECL技術平臺
膜蛋白抗原需具有相關作用的完整構象和轉錄後修飾；表達胞外N端或Loop區結構域的方法簡單，並且相對而言有較高的表達量，是行之有效的方法之一。

近岸蛋白採用哺乳動物細胞表達系統，能夠指導蛋白質的正確折疊，提供複雜的N型糖基化和準確的O型糖基化等多種翻譯後加工功能，因而表達產物在分子結構、理化特性和生物學功能方面最接近天然高等生物蛋白質分子。

技術路線
多次跨膜蛋白ECL方案設計→質粒構建與抽提→表達方案篩選→蛋白純化→活性檢測&品質檢測

2. 去垢劑技術平臺
　　多次跨膜蛋白在細胞膜上多次穿越，在胞外形成多個胞外區，比如Claudin18.2、CD20都有兩個ECLs（Extracellular loops），每個ECL都有特定功能甚至會相互影響。只表達蛋白胞外區的方式很難類比蛋白的天然構象，可能造成一些抗原構象表位的丟失，也有可能對蛋白活性有一定的影響。全長多次跨膜蛋白可以保證蛋白構象天然完整，而且ECL展現完全，幫助篩選靶向多次跨膜蛋白抗原的理想抗體。
　　然而跨膜蛋白具有疏水結構域，跨膜蛋白與脂膜的結合緊密，需要用去垢劑（detergent）才能從膜上洗滌下來，去垢劑同時具有親水極性基團和疏水非極性基團，在溶液中為去膜狀態下的膜蛋白提供疏水環境，維持膜蛋白的疏水跨膜結構。
近岸蛋白以哺乳動物細胞表達技術為基礎，搭建了全長多次跨膜蛋白的表達平臺和純化平臺，並且已篩選出幾種效果很好的去垢劑，能夠增溶和純化跨膜蛋白，並在含有去垢劑的溶液中維持天然正確的構象。
技術路線
多次跨膜全長蛋白方案設計→質粒構建與抽提→表達方案篩選→蛋白純化→活性檢測&品質檢測

3. VLP技術平臺
　　VLP是Virus Like Particle的簡稱，VLP來源於病毒的外層衣殼蛋白，由一種或者多種衣殼蛋白組分自動組裝形成的納米級別的微小顆粒。由於VLP顆粒由病毒衣殼蛋白自組裝而成，因此不含有病毒基因組，而其特殊的空間結構能夠引起強烈的免疫應答反應，這樣的特性使得VLP可以作為重組亞單位疫苗^[4]。
　　VLP主要分為eVLP和非包膜VLP，在VLP由包膜病毒的衣殼蛋白組裝時，通過從宿主細胞出芽，VLP被細胞膜包裹，能夠使細胞膜上的跨膜蛋白展示在VLP上。基於VLP高效地啟動機體體液和細胞免疫反應應答的效果，使得免疫原性弱的抗原/多肽免疫動物時都能夠得到有效的抗體。
技術路線
多次跨膜全長蛋白方案設計→質粒構建與抽提→VLP表達展示→VLP富集→活性檢測&品質檢測

表1：不同技術平臺優劣勢對比

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相關產品簡介
1. Claudin18.2
Claudin18.2 (CLDN18.2)是Claudin蛋白質家族的一員，位於細胞膜表面，由兩個細胞外環(ECLs)、四個跨膜結構域和一個細胞質結構域組成。CLDN18的C端和N端都位於細胞質中。正常情況下僅低水準表達於胃粘膜分化上皮細胞，但在病理狀態下，Claudin18.2在多種腫瘤中有的表達顯著上調。此外，Claudin18.2在胃食管癌、胰腺癌、肺癌和其他實體瘤中通常過度表達，因此是具有潛力治療癌症的熱門靶點。據藥渡資料庫統計，目前全球在研CLDN18.2藥物約97款，涉及到單抗、雙/多抗、細胞療法、ADC等不同的藥物類型。

圖2：Claudin18.2結構示意圖^[5]

^{部分資料展示}

<sup>Immobilized Human CLDN18.2-Twin strep-Flag (Cat#C17D) at 5μg/ml (100 μl/well) can bind Anti-Human Claudin18.2 mAb (Cat#NC004). The ED50 of Anti-Human Claudin18.2 mAb (Cat#NC004) is 29.75 ng/ml.

Loaded Anti-Human Claudin18.2 mAb (Cat#NC004) on AHC Biosensor, can bind  Human Claudin18.2-Flag (Cat#C17D) with an affinity constant of 6.76 nM as determined in BLI assay.</sup>

2. Napi2b
<sup>NaPi2b(2b型鈉依賴性磷酸鹽轉運體)是一種多通道的膜蛋白，是溶質載體SLC34家族的成員，該家族由NaPi-IIa（SLC34A1）、NaPi-IIb（SLC34A2）和NaPi-IIc（SLC34A3）構成。其中NaPi-IIb蛋白通過鈉離子共轉運介導無機磷酸鹽進入上皮細胞，負責維持全身的磷酸鹽平衡。NaPi2b在卵巢癌和非小細胞肺癌腺癌中廣泛表達，但在正常組織中較少表達。
代表性在研藥物：Mersana的upifitamab rilsodotin（XMT-1536，UpRi）

圖3：Napi2b結構示意圖[6]</sup>

部分數據展示

Immobilized Human NaPi2b ECL2-Fc (Cat#C27G) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody(7C9)*(Cat#NC091).*: Biotinylated by NHS-biotin prior to testing. The ED50 of Human NaPi2b Antibody(7C9) (Cat#NC091) is 50.90 ng/ml. 

Immobilized Recombinant Human NaPi2b (VLP) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091). The ED50 of Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091) is 41.35ng/ml. 

Immobilized Recombinant Human NaPi2b-6His-Flag (Cat#C27K) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Anti-Human NaPi2b Antibody (Cat#NC091). The ED50 of Anti-Human NaPi2b Antibody is 15.35ng/ml.

Immobilized Recombinant Mouse NaPi2b-Flag (Cat#C27W) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091). The ED50 of Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091) is 1.65ng/ml. 

Immobilized Recombinant Cynomolgus NaPi2b-Flag (Cat#C27X) at 2μg/ml (100 μl/well) can bind Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091). The ED50 of Human NaPi2b Antibody (7C9) (Cat#NC091) is 3.61ng/ml.

3. CD20
　　CD20是位於B細胞上的一種非糖基化磷蛋白，屬於MS4A蛋白家族（四次跨膜蛋白家族A），主要在前B細胞到成熟B細胞階段表達。CD20蛋白由四個疏水跨膜結構域組成，一個胞內結構域和兩個胞外結構域（大環和小環），N端和C端均位於胞質內。CD20在正常和惡性B淋巴細胞表面表達，而在造血幹細胞、血漿細胞和其他正常組織中不表達。因此，CD20 被認為是一個治療B細胞惡性腫瘤及自體免疫疾病的重要靶點。據藥渡資料庫統計，國內外多家企業展開針對CD20靶點的藥物研發，涉及到單抗、雙/多抗、細胞療法、ADC等不同的藥物類型，超150多個研究管線處於臨床前期或已進入臨床階段，超50款藥物已經批准上市。


圖4：CD20結構示意圖^[7]