核酸檢測技術之ARMS-qPCR，基因點突變檢測利器

Novoprotein 2023-08-10 15:32 發表於浙江

　　聚合酶鍊式反應（Polymerase Chain Reaction, PCR）因其快速、方便等優勢，目前佔據了臨床分子診斷市場的90%。這種創新且簡便的技術，是分子診斷領域的強大工具，也是如今許多主流癌症診斷的基礎。隨著醫學研究的不斷發展，腫瘤檢測、靶向治療隨之越來越成熟。研究發現，許多癌症/遺傳病與基因突變、病毒感染等具有顯著關聯，同時，靶向治療的前提是對藥物的分子靶點進行基因檢測，找到導致腫瘤或遺傳病發生的基因突變。
　　ARMS-PCR即擴增阻滯突變系統PCR（Amplification Refractory Mutation System PCR，ARMS-PCR），又稱為等位基因特異性PCR（Allele-Specific PCR，AS-PCR），是一項在PCR基礎上發展起來的新方法，可檢測出DNA中各種點突變，是目前國際上腫瘤個體化分子檢測最重要、應用最廣泛的技術之一，其在臨床應用中的優勢已被業內專家廣泛認可。

ARMS PCR的工作原理
ARMS PCR引物設計時等位基因兩條上游引物中3'端核苷酸不同，兩條引物分別對野生型和突變型進行特異性擴增時，與範本不能完全匹配的上游引物將不能與範本完全形成互補鹼基對，形成錯配，一方面，鹼基錯配會影響產物延伸，另一方面，錯配鹼基會改變等位基因變體的退火溫度，最終導致不同基因型擴增效果的差異，對差異進行檢測即可確認基因型。

圖1.ARMS-PCR的工作原理^[1]

ARMS-PCR產物的檢測
1. 瓊脂糖凝膠電泳：取一定量PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過條帶的位置來確定基因型。
2. 熔解曲線分析：ARMS-PCR體系中加入染料/探針，對PCR產物進行熔解曲線分析，根據熔解曲線的位置來確定基因型。
3. 實時熒光檢測：採用TaqMan探針，通過分析熒光數據確認其基因型。目前市場主流即為該檢測方式（ARMS-qPCR）。

ARMS-PCR是遺傳病診斷最準確的技術工具之一，在癌症/遺傳病篩查和靶向治療領域也有著重要貢獻。其主要優勢是操作便捷、快速、靈敏度高，對器材成本要求較低，有大量成熟的商品化試劑盒可供使用等。

表1：國家藥品監督管理局已註冊ARMS相關檢測試劑盒


ARMS-PCR的高特異性要求
從ARMS-PCR的原理上來看，該檢測方法對PCR體系的特異性要求較高。保證特異性可以從以下兩方面著手：
1. 優化引物設計：常見手段之一是引入超過一個錯配鹼基，通常在3'端的倒數第二或第三位，與末端錯配鹼基共同作用，使不互補的擴增產物顯著降低；同時減少PCR擴增的循環數，因為循環數增加會增加假陽性結果的機率。
2. 調整反應體系中相關組分以提高反應體系的特異性。
近岸蛋白全新推出針對ARMS方法調配的qPCR預混液（目錄號：E406），具有超高的阻滯擴增性能。已進行多樣本、多靶標驗證，客戶回饋性能優異，更有多重ARMS-qPCR預混液提供測試。
產品特點

• 高特異性：超高的阻滯擴增性能
• 通用性好：經多樣本、多靶標驗證
• 高穩定性：全預混體系37℃加速7天，產品性能不變

數據展示
高特異性-超高的阻滯擴增性能，顯著區分突變型與野生型（客戶樣本）。

通用性好-經多樣本、多靶標驗證
擴增性能驗證-標準曲線R²達到0.999，擴增效率達100%左右。

高穩定性-全預混體系穩定性驗證：在擴增體系中加入引物、探針，37℃存放0、1、3、5、7天，產品性能不變。
質粒範本濃度梯度：10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl、10fg/μl、1fg/μl、0.1fg/μl。

客戶專案及回饋
1. 腫瘤相關基因突變的SNP分型，性能優於客戶測試的其他品牌產品；
2. 白血病融合基因檢測，微滴式數位PCR（ddPCR）平臺，性能優於客戶測試的其他品牌產品。

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