近岸類器官課堂-腦力特攻隊

腦是動物界中最高度發展的大腦，也是我們身體中最複雜的器官。由於其獨特的複雜性，很難用動物系統模擬人類大腦的發育。然而，人腦類器官現在已經成功地用於模擬人腦發育和疾病發生。人類腦類器官培養是一項令人興奮的新技術，科學家們基於模擬內源性發育過程，透過將多能幹細胞（PSCs）進行誘導分化及自組裝後，在體外重現了人類大腦發育的進程。最近的研究表明，腦類器官可以模擬神經發生的時空動態、區域神經迴路的形成以及膠質細胞整合成神經網路。這項技術可以幫助我們探索大腦發育、新陳代謝機制，並進行藥物功效測試。
由於人類腦類器官的結構複雜，本文基於Nature protocols的方案，以背側(hCS)前腦球體為例，簡要介紹來源於PSCs的腦類器官培養流程^【1】。

人類腦類器官的培養
材料>
細胞： hPSCs或iPSCs細胞 
主要培養基>
基礎培養基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，10 ng/ml FGF2）
神經誘導培養基（主要成分：20% KSR，1% NEAA，0.5% GlutaMAX，0.1mM 2-Mercaptoethanol，5μM DM，10μM SB，10μM Y-27632）
神經分化培養基（主要成分：2% B27，1% GlutaMAX，20 ng/ml hEGF，20 ng/ml hFGF2，20 ng/ml hBDNF，20 ng/ml hNT3）
實驗步驟>
1.在塗有基質膠的平板上接種hPSCs或iPSCs細胞，並添加基礎培養基進行培養，至出現明顯細胞團。
2.將30-50個細胞團輕輕重懸於12 ml神經誘導培養基中，轉移至10cm超低附著平板，將這一天記為第0天。將平板放在37℃、5%CO ₂的培養箱中培養48小時。
3.接下來以12 ml神經誘導培養基(不含Y-27632)培養72小時。
4.從第6天開始，使用添加了20 ng/ml FGF2和20 ng/ml EGF的神經分化培養基。
5.從第12天到第15天，繼續每天以添加20 ng/ml hFGF2和20 ng/ml hEGF的神經誘導培養基培養。
6.從第16天開始，繼續使用添加了20 ng/ml FGF2和20 ng/ml EGF的神經分化培養基進行培養，每隔一天換液一次，直到第25天。
7從第25天到第43天，以20 ng/ml BDNF和20 ng/ml NT3取代神經分化培養基中的FGF2和EGF，每隔2-3天換液一次。
8從第43天開始，每隔4天用17-18ml不含生長因子的神經分化培養基換液。在正確操作下，所產生的hCS球體可在培養中維持培養數月。 

圖1. 體外培養背側(hCS)前腦類器官的時間線^【1】

人腦類器官的應用
在過去的幾年中，腦類器官系統已被廣泛用於研究人類大腦疾病。由於腦類器官所經歷的培養與人類胎兒大腦的發育步驟相似，所以它們適用於模擬具有實際病因的神經發育障礙；同時，透過模擬腦類疾病的進展，可以實現藥物的篩選。

據統計數據，約5%的世界人口患有神經發育障礙。明確神經發育障礙的原因，並建立適當的臨床前模型，對於開發新的治療方法是非常重要的。小頭畸形症就是使用腦類器官模擬腦部疾病的早期例子。小頭症腦類器官源自於一名小頭症患者的iPSCs，該患者在CDK5調節亞單位相關蛋白2(CDK5RAP2)存在突變，這被假定為小頭症的風險因子。與對照組類器官相比，患者源性類器官中的極化神經前體細胞增殖減少、分化提前；此外，對照組類器官中CDK5RAP2的敲除導致了類似的表型，這表明CDK5RAP2功能的喪失是人類小頭畸形症的病因之一^【2】。這項研究是第一個使用腦類器官來模擬神經發育障礙的例子，並透過CRISPR/Cas9技術將腦類器官進行基因編輯，為人類了解腦類疾病的機制奠定了基礎。

人類腦類器官模型同樣為研究感染病的發病機制提供了生理相關的平台。在ZIKV病毒肆虐期間，有人提出包括小頭畸形在內的神經系統疾病可能與ZIKV病毒之間存在關聯。儘管當時可以在小頭畸形胎兒組織中檢測到ZIKV病毒，但ZIKV可能損害大腦發育的機制仍不清楚。因此許多研究使用了3D腦類器官模型，揭示了ZIKV感染對人腦發育的影響^【3】。

大腦類器官技術的歷史較短，仍處於起步階段。就細胞和分子組成而言，目前用於產生類腦器官的方案可以模仿妊娠中期左右的人類胎兒的大腦結構。由於類腦器官沒有帶血管的循環系統，所以它主要依靠來自培養基的簡單擴散來供應氣體和營養。當長時間培養時，由於缺乏氧氣和營養，類器官中的大量細胞發生凋亡。2019年，WIMMER等人成功培養出了包含內皮細胞和外膜細胞的人類血管類器官^【4】。未來的人類大腦類器官技術可以與血管類器官結合在一起，建立一個功能性的封閉循環系統，以支持類器官的長期培養，並研究神經和血管的相互作用。
※Zhu團隊利用近岸蛋白（Novoprotein）生產的bFGF因子（4ng/ml），成功培養了人類腦類器官，經免疫組化檢測，PAX2（早期發育的前腦、中腦和後腦標記）和PAX6（前腦標記）均有明顯表現。並以此作為模型，深入研究了酒精對人腦類器官神經發生的損害，相關結果已於2017年發表在Lab on a Chip ^【5】和 Integrative Biology ^【6】。

圖2. PAX2（早期發育的前腦、中腦和後腦標記）和PAX6（前腦標記）均有明顯表達^【6】

Novoprotein自主研發生產的低內毒素Activin A、FGF系列、HGF、R-Spondin 1、Noggin和Wnt3a等細胞因數，內毒素低至＜10EU/mg，具有高活性、高純度、高批間一致性，為類器官培養設計，已獲得市場認可，讓您研究放心！