mRNA加帽率檢測工具箱攜手樣品處理試劑盒，一站式解決探針設計及分子量計算之憂！
Novoprotein 2023-07-26 18:33 發表於浙江
mRNA作為疫苗及藥物，最終應用於人體，其品質控制需要與其他藥品一樣，安全可控是最基本的要求。根據中國《體外基因修飾系統藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，要求對RNA類基因修飾系統工藝參數進行程序控制檢測，如加帽率、加Poly(A)尾長度及分佈、mRNA序列完整性、序列準確性等。同時，USP的兩版《mRNA疫苗品質分析方法-指南草案》也都涵蓋了關於mRNA加帽率等品質屬性的檢測要求及檢測方法建議。
3.2 類基因修飾系統
mRNA的完整性確保了蛋白質的準確翻譯，5’-Cap帽結構修飾[1]可以保護mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促進翻譯的起始、降低免疫原性。按照GMP標準條件，每生產一批mRNA都需要對mRNA的加帽率等進行嚴格測定，mRNA加帽率檢測是mRNA品質控制的重要指標。
加帽率檢測過程
1. 檢測原理
利用一種特殊裂解探針法進行mRNA加帽率分析。通過設計mRNA 5’端互補探針，退火形成RNA/DNA雜合鏈，利用RNase H在特定位置從mRNA的5'末端切割短序列，並用液相色譜-質譜聯用儀（LC-MS）分析獲得加帽率。
2. 探針設計
根據目標樣品5’端序列，進行酶切探針設計。為了方便加帽率檢測探針設計，降低序列轉換錯誤率，減少酶切產物等分子量計算工作量，Novoprotein 特別推出「mRNA加帽率檢測工具箱」，包括探針設計、反應體系計算、酶切產物分子量計算等模組。
網址 https://www.novoprotein.com.cn/tool-class。
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在探針設計方面，Novoprotein依靠豐富的加帽率檢測經驗，優化探針設計原則，區別於傳統設計方案中RNA+DNA探針序列，將探針中DNA鹼基設計在2'-O-甲基修飾的RNA鹼基序列中間，形成RNA+DNA+RNA序列，既保證了探針結合，又減少了非特異性酶切的發生。
傳統探針設計方案酶切後結果：次裂解產物較多，非特異性酶切情況複雜，影響LC-MS結果分析。
Novoprotein探針設計方案酶切後結果：既保證了探針結合，又減少了非特異性酶切的發生，次裂解產物少，方便LC-MS結果分析。
此處理將探針與目標mRNA退火形成DNA/RNA雜交雙鏈後，引導RNase H在特定位置切割mRNA。再用鏈黴親和素磁珠捕獲與切割的片段配對的生物素標記的切割探針，將切割片段分離。最後更換溶劑條件，從探針中釋放結合的mRNA，含有裂解產物與探針的上清液用於LC-MS分析。
針對很多客戶面臨的實驗效率低，重複性不佳的問題，Novoprotein重磅推出磁珠法樣品處理完整試劑盒（目錄號：CD001），涵蓋所有加帽率樣品處理所需試劑，用戶只需要準備mRNA樣品即可。
產品特點：
1). 一步完成探針結合與酶切，操作簡便快速，全流程僅需1.5-2小時
2). 特殊設計的裂解探針有效減少次裂解產物形成，便於後續加帽率檢測結果分析
3). 可用於不同加帽工藝生產mRNA樣品處理
4). 酶切mix穩定性強，37℃ 21天，反復凍融150次，酶切活性無影響
此試劑盒搭配Novoprotein特別開發的反應體系及酶切產物分子量計算工具箱，根據RNA及探針序列，選擇不同堿基修飾及加帽方式，可快速預測不同酶切產物分子量，極大方便了LC-MS結果分析。
網址 https://www.novoprotein.com.cn/tool-class
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4. LC-MS測定結果
將處理好的樣品上機（LC-MS）測定mRNA加帽率
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參考文獻
[1] SHANMUGASUNDARAM M, SENTHILVELAN A, KORE A R. Recent Advances in Modified Cap Analogs: Synthesis, Biochemical Properties, and mRNA Based Vaccines [J]. Chem Rec, 2022: e202200005.