mRNA模板製備用酵素有哪些講究？
原創 Novoprotein 2023-12-07 19:20 發表於浙江
以T7啟動子為核心的mRNA轉錄，其模板製備可以有以下幾種方式：
- 質粒模板：帶有T7啟動子的質粒可以作為轉錄模板。環狀質粒由於沒有有效的終止，會轉錄出不同長度的RNA產物，為了得到特定長度的RNA，因此，質粒必須完全線性化，線性化的質粒需確保雙股為平末端或5'端為突出結構。
- PCR產物模板：PCR擴增模板時將T7啟動子加在有義鏈的上游引子的5'端，PCR產物純化後作為模板。
- 合成DNA模板：合成的帶有T7啟動子的DNA片段也可以作為體外轉錄的模板。
mRNA疫苗生產過程中，線性化質粒模板因其相對穩定的生產製程等優勢成為主流方式。在選擇質粒線性化工具時，IIS型限制性內切酶是mRNA模板製備的首選，原因是其酶切位點在識別位點以外，酶切後可將Poly A結構直接暴露在3'端而不產生冗餘的酶切位點殘基，從根本上杜絕多餘鹼基所造成的不確定性。
BspQI和BsaI作為一種IIS型限制性內切酶，被廣泛應用於mRNA模板製備，其酶切識別位點分別長達7個和6個鹼基，具有高度特異性，極不容易在目標序列中出現相同酵素切位點，能夠有效避免出現非特異性的酶切。
圖一：BspQI酶切識別位點
圖二：BsaI酶切辨識位點
此外，在質粒線性化過程中，也要求酶切產物必須為5'端突出末端，因為如果酶切產生3'突出末端的模板，在體外轉錄（IVT）時，就會增加副產物dsRNA的生成風險，而dsRNA是一類免疫反應的強刺激物，需要嚴格控制，才能確保mRNA疫苗的有效性。質粒線性化中，除了上述兩種酶，XbaI因其可產生5'端突出序列也常被應用於生產中。
圖三：XbaI酶切辨識位點
Novoprotein蛋白在推動mRNA疫苗研發生產過程中不斷探索創新，三款GMP級限制性內切酶BsaI、BspQI和XbaI，為客戶提供更多的酵素切位點選擇。
產品特點
- 酶切活性高
圖四：M為Marker；1為陰性；2為常規反應體系酶切結果；3為反應體系內buffer調整用量至4μl；4為反應體系內BspQI酶調整用量至0.8μl ；5為反應體系內調整質粒用量至1.5μg。結果無明顯差異，證明酵素活性高，可適應反應體系內各組分調整。
圖五：MK為Marker；2-8Lane為在雙酶切體系中，相同BsaI酶量前提下，增加質粒用量至10μg。結果顯示均可實現完全酶切，證明酶活性高，反應底物可依具體切割質粒類型靈活調整。
圖六：M為Marker；1為500ng底物；2為1μg底物；3為5μg底物；4為7.5μg底物；5為10μg底物；6為15μg底物；7為30μg底物； 8為45μg底物；常規反應體系內，Novoprotein蛋白XbaI可完全酶切15μg底物，證明酵素活性高，反應底物可依具體切割質粒類型靈活調整。
- Buffer相容性好
圖七：M為Marker；1為陰性；2為Novoprotein蛋白BspQI及對應反應Buffer體系；3為N品牌BspQI及對應反應Buffer體系；4為Novoprotein蛋白BspQI與Buffer1反應體系；5為Novoprotein蛋白BspQI與Buffer2反應體系；6為Novoprotein蛋白BspQI與Buffer3反應體系；7為Novoprotein蛋白BspQI與Buffer4反應體系。結果無明顯差異，證明Novoprotein蛋白BspQI適配市面上常見酵素切反應Buffer，相容性佳。
- 熱穩定性好
圖八：左圖為37℃放置0天，右圖為37℃放置7天；Lane1為1ul酶用量，Lane2-6為2倍酶活梯度稀釋，Lane7為陰性，結果顯示BspQI酶活無明顯變化，證明其熱穩定性強。
圖九：左圖為37℃放置0天，右圖為37℃放置7天；Lane1為1ul酶用量，Lane2-6為2倍酶活梯度稀釋，結果顯示XbaI酶活性無明顯變化，證明其熱穩定性強。
- 過夜酶切及甘油濃度變化，無星號活性
圖十：M為Marker；1為陰性；2為N品牌10U BspQI；3為Novoprotein蛋白10U BspQI；4為Novoprotein蛋白20U BspQI；5為Novoprotein蛋白40U BspQI；以lamda-HindIII DNA為底物（底物中含有兩個BspQI酶切位點），過夜酶切（16h），結果顯示Novoprotein蛋白BspQI星號活性極低。
圖十一：M為Marker；1為甘油濃度1%，反應1小時；2為甘油濃度1%，反應16小時；3為甘油濃度5%反應16小時；4為甘油濃度10%，反應16小時。結果顯示Novoprotein蛋白XbaI無星號活性。
Novoprotein蛋白提供從模板製備到原液生產全套RNA原料酵素及試劑，歡迎諮詢。
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