近岸類器官課堂-乳癌

Novoprotein 2022-09-02 12:57 發表於浙江

乳癌是最常見的癌症，在2022年美國癌症協會發表的癌症統計報告中指出，2014年至2018年期間，女性乳癌的發生率持續緩慢增長（約每年增加0.5%），而在2022年度女性確診的癌症中，乳癌、肺癌和大腸癌發生率佔所有癌症種類的51%，光是乳癌就佔近三分之一^【1】。
乳癌通常從乳管過度增生開始，經過各種致癌因素的不斷刺激後，再發展成良性腫瘤甚至轉移性癌症^【2】。乳癌的發生和發展機制有兩種假設理論：癌症幹細胞理論和隨機理論。癌症幹細胞理論認為，所有腫瘤亞型都來自相同的幹細胞或祖細胞，幹細胞或祖細胞中獲得性遺傳和表觀遺傳突變將導致不同的腫瘤表型；而隨機理論則認為，每種腫瘤亞型都是從單細胞類型（幹細胞，祖細胞或分化細胞）開始的，隨機突變可以在任何乳腺細胞中逐漸積累，導致它們轉化為腫瘤細胞。雖然這兩種理論都得到了大量數據的支持，但都無法完全解釋人類乳癌的發病原因。因此，在體外進行培養的乳癌類器官模型能夠作為患者的“替身”，在研究致病機理的同時，能夠幫助患者預測多種治療方案的效果，是個人化醫療的有利工具。
本篇文章基於Nature protocols ^【3】和Cell ^【4】發表的兩篇文章，整理了病人組織來源的乳癌類器官培養方案。

圖1. 病人組織來源的乳癌類器官培養方案^【3】
細胞來源
切片樣本或手術樣本
培養基配方

組織處理
1.將新鮮乳癌組織樣本放入預冷的含有1% BSA的DMEM-F12培養基中，剔除脂肪組織和壞死的腫瘤組織（通常為黃色或白色），只選取活的腫瘤組織（通常為粉紅色）。
2.將組織轉移到含有5 mL預冷的PBS溶液中清洗，去除血液和碎片。為防止污染，需多次重複此步驟至液體變澄清。
3. 吸出PBS，加入含有1% BSA的DMEM-F12培養基。將組織切割為0.5–1 mm ³的小塊，此步驟可留存適量組織用於定序、免疫組化分析等。
4. 將剩餘組織塊切碎，並加入1 ml含有1% BSA的DMEM-F12培養基，用p1000吸頭將腫瘤碎片懸浮液轉移到含有5 ml解離培養基的離心管中，輕輕震盪混合後，放置於37℃恆溫搖床中震盪解離1-2h，調整轉速約140 rpm。每30分鐘將離心管上下顛倒混合5-10次，並取少量在顯微鏡下觀察。當鏡下出現5-10個細胞/簇時，停止解離。
5. 加入1ml FBS終止消化。
6. 將懸浮液經過100μm細胞篩網過濾，收集解離的細胞。
7. 將過濾的細胞懸浮液在4℃條件下450g離心5min。
8. 若細胞沉澱有明顯的紅色，則將細胞重懸於5ml的紅血球裂解液中，冰上孵育10min使紅血球裂解。
9. 將細胞懸浮液加入5ml DMEM-F12沖洗細胞一次，離心收集細胞沉澱後，加入1-2ml DMEM-F12重懸細胞，並進行台盼藍染色觀察活細胞佔比。
類器官培養
10. 將凍存的BME在4℃下過夜解凍，在冰上以200μl:50μl的體積比將BME與細胞懸浮液混合，輕輕吹打混勻避免產生氣泡。
11. 從37℃培養箱中取出預熱的12孔板，將100μl混合液接種在各孔中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。
12.將12孔板翻轉後，室溫放置5min；然後轉移至37℃，5%CO ₂的培養箱中，正置孵育30min，使BME固化。
13. 在每個孔中緩慢滴加750 µl 預熱的類器官培養基，確保基質膠被完全覆蓋。放於37℃，5%CO ₂的培養箱中培養，每2-4天更換培養基。
類器官繼代
14. 吸出類器官培養液，加入2ml預冷的DMEM-F12培養基，機械吹打後加入2 mL TrypLE Express。室溫孵育1–5min後，用移液管多次吹打，從基質膠釋放類器官。
15. 以含有10%FBS的DMEM-F12培養基終止消化，在4℃條件下300g離心5min。
16. 用冷PBS清洗後，再次4℃條件下300g離心5min。
17. 將所得沉澱依1：2-1：8的比例重複10-13步驟（具體比例透過類器官的匯合度確定），完成繼代。
類器官凍存
18. 當顯微鏡下類器官的尺寸達到100-150μm時，可以考慮進行凍存。
19. 取3-4個孔的類器官，消化離心後取細胞沉澱，加入1ml細胞凍存液。
20. 將細胞重懸後轉移至凍存管中，利用程序降溫盒緩慢降溫至-80℃。
21. 第二天，將樣本轉移到液態氮中長期儲存。
類器官復甦
22. 將液態氮凍存的乳癌類器官放置在37℃水浴鍋中解凍，水浴時間不宜超過2min。
23. 將細胞懸浮液轉移至15ml離心管中，加入10ml預冷的DMEM-F12培養基（含10% FBS）。4℃條件下300g離心5min，取細胞沉澱。
24. 將所得沉澱物重複10-13步驟，完成乳癌類器官的復甦。

圖2. 不同類型乳癌來源的乳癌類器官形態特徵^【3】
乳癌類器官應用前景
類器官模型可以有效反映腫瘤的異質性，並且透過定序結果證實，大多數類器官可以很好地保留來源組織的基因特性。Goldhammer N等人^【5】提供的數據表明，在早期繼代中，病灶組織和體外培養類器官之間的相似度最高。在過去的幾年中，隨著消化步驟的優化和實驗技術的不斷改進，乳癌類器官的培養成功率已提高到~80%，這也將成為進一步研究乳癌的有效模型（圖3） 。

圖3.乳癌類器官的演化過程^【6】 

Cassidy 等人^【7】利用乳癌類器官篩選了18種抗癌藥，發現了培美曲塞合併卡鉑、吉西他濱和吡羅替尼的用藥比其他方案對乳癌抑制率高出60%；將乳癌類器官進行WGS定序，可以尋找對Olaparib和Nilapali更敏感的高表現BRCA1/2患者。因此，透過乳癌類器官的基因檢測和藥物檢測，擴大了患者的治療選擇範圍，也為患者提供了更精準的治療方案。

參考文獻：
【1】Rebecca L. Siegel MPH, et al. Cancer statistics, 2022[J]. CA: a cancer journal for clinicians, 2022, 72(1): 7-33.
【2】Sun YS, et al. Risk factors and preventions of breast cancer[J]. International journal of biological sciences, 2017, 13(11): 1387.
【3】Dekkers JF, et al. Long-term culture, genetic manipulation and xenotransplantation of human normal and breast cancer organoids[J]. Nature protocols, 2021, 16(4): 1936-1965.
【4】Sachs N,, et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity[J]. Cell, 2018, 172(1-2): 373-386. e10.
【5】Goldhammer N, et al. Characterization of organoid cultured human breast cancer[J]. Breast Cancer Research, 2019, 21(1): 1-8.
【6】YU, Jin; HUANG, Wei. The progress and clinical application of breast cancer organoids. International Journal of Stem Cells, 2020, 13(3): 295-304.
【7】Cassidy JW, et al. Patient-derived tumour xenografts for breast cancer drugvery[J]. Endocrine-related cancer, 2016, 23(12): T259-T270.