近岸類器官課堂-小血管，大網絡

血管是胚胎最早發育的器官之一，也是所有其它器官功能的基礎。

Novoprotein 2022-11-04 20:00 發表於浙江

血管是胚胎最早發育的器官之一，也是所有其它器官功能的基礎。血管系統由兩種細胞類型構成：內皮細胞(Endothelial cells)和壁細胞（Mural cells），其中壁細胞是周細胞（Pericytes, PC）和血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells, vSMCs）的統稱。內皮細胞組成血管的內壁，是血管管腔內血液及其他血管壁（單層鱗狀上皮）的介面；而壁細胞在維持血管壁的完整性方面起著關鍵作用【1 ^】。在發育過程中，在纖維母細胞生長因子2 (FGF-2)、骨形態發生蛋白4 (BMP4)和血管內皮生長因子A (VEGF-A)的刺激下，內皮細胞在中胚層祖細胞中產生，並組成原始管狀網。隨後，在血管生成的過程中，原有的神經叢進行重塑，新的血管發芽和分支，直到一個成熟的循環網絡形成^【2】。

本篇文章基於Nature protocols ^【3】發表的文章，整理了人類多能幹細胞（hPSCs）來源的血管類器官培養方案。培養過程遵循發育原理，依靠上述生長因子進行誘導分化，最終培養成為血管類器官網絡。

圖1. hPSCs來源的血管類器官培養方案^【3】
細胞來源
hPSCs
培養試劑配方

hPSCs培養
1. 將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋動6孔板使Matrigel分佈均勻。接著轉移至37℃條件下培養10min使其凝固，使用前需室溫靜置1h。
2. 將hPSCs接種在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml E8培養基，放置在37℃，5%CO ₂的培養箱中，培養至細胞匯合度約為75–85%、且大部分無分化的狀態時，吸出培養基。
3. 向hPSCs中加入0.5 mM EDTA洗滌細胞一次。
4. 吸去EDTA溶液，每孔加入0.6ml Accutase，並將培養皿放置在37℃解離約3-5min，直到所有的細胞變圓。
5. 在每個孔中加入5ml的hPSCs培養基，並以0.1%台盼藍進行染色計數。
6. 將所有細胞轉移至15ml離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉澱細胞。6孔板中每孔接種2×10 ⁵個細胞，加入預熱的3ml hPSCs培養基，放置於37℃，5％CO ₂培養箱中進行培養。
誘導中胚層分化
7.  hPSCs培養1天至形成具有平滑邊界的聚集體，直徑>50-100 µm 。
8. 聚集體形成後，將所有細胞轉移至15ml離心管中，並依靠重力自然沉澱（注意：不建議將聚集體離心處理）。靜置15-20min後，小心吸去培養基上清。
9. 將聚集體以10ml hPSCs中胚層分化培養基輕輕重懸，加入低吸附的6孔板中，每孔3ml，放置在37℃，5％CO 2培養箱中孵育3天以誘導中_胚層分化，培養期間每天用1ml槍頭吹打避免過度聚合。
10. 重複步驟8，將培養基替換為中胚層分化培養基-2，放置於37℃，5％CO ₂培養箱中培養2天。
血管類器官形成
11. 將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，在12孔板中每孔鋪0.5ml 第一層膠原蛋白（1.5mg/ml collagen I+ 25％ Matrigel），輕輕旋轉孔板使溶液分佈均勻。
12. 將12孔板放置在37℃條件下固化2小時。
13. 依步驟8收取細胞沉澱，加入1ml StemPro-34 SFM完全培養基清洗細胞一次。
14. 計算聚集體的數量，將聚集體以Collagen I 溶液重懸並置於冰上，調整聚集體的密度為40-60個細胞團/50μl。
15. 從培養箱中取出含有第一層膠原蛋白的12孔板，並小心地在12孔板的每個孔中加入0.5 mL含細胞聚集體的Collagen I溶液。前後晃動平板，使細胞均勻分佈在孔內。
16. 將12孔板放置在37℃條件下固化2h。
17. 加入預熱的3ml 血管分化培養基，放置於37℃，5％CO ₂培養箱中進行培養。血管芽會在培養的1-3天出現。培養3天後換液，之後每隔一天換液一次。
18. 大約10天後可以將血管類器官固定染色或採用其它方案進行下一步分析。
圖2. 血管類器官的形態^【3】

血管類器官的應用前景
血管是血液運輸營養物質和氧氣的管道，對維持組織和器官的穩態有著重要的作用。目前已知有多種疾病與血管異常有關。在成年人中，血管功能障礙與中風^【4】、心臟病^【5】、糖尿病^【6】、動脈粥狀硬化^【7】、癌症^【8】等主要疾病息息相關。
其次，類器官技術雖然已經日趨成熟，但仍有一些限制阻礙了其更廣泛的應用。目前3D培養中的類器官僅依賴被動擴散來交換營養物質、氧氣和代謝廢物，然而擴散的有效距離通常不超過300μm，這也導致類器官的中心常常發生壞死。透過將類器官與血管系統共同培養，可以顯著增加類器官的尺寸與壽命^【9】，圖3列舉了類器官血管化的方案。
我們設想，當類器官血管化這項技術成熟時，它將成為類器官技術應用進一步擴大的寶貴工具。

圖3. 類器官血管化的方案^【10】

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