近岸類器官課堂-大腸直腸癌

近岸類器官課堂-大腸直腸癌

Novoprotein  2022-06-30 19:44 發表於上海

大腸直腸癌（Colorectal Cancer, CRC）是全世界最常見的癌症之一。在過去的十年中，預防性篩檢計畫的推廣使死亡率大幅下降，然而在許多國家範圍內，結直腸癌仍然是癌症相關死亡的第二大原因^【1】。

幾十年來，癌細胞系和基因編輯小鼠^【2】一直是CRC研究的主要模型，人類腫瘤患者衍生異種移植(PDX)也已成為了CRC研究的工具^【3】。同時，能夠在體外進行長期培養的原發性/轉移性CRC類器官模型進一步擴大了研究人員的選擇範圍。類器官既可以像PDX一樣代表了個別患者的真實腫瘤情況，又兼具了細胞系的可繼代、易於高通量篩選等特性。因此，CRC類器官模型正廣泛應用於藥物研究、個人化醫療等領域。

本篇文章基於Nature Chemical Biology ^【4】、STAR protocols ^【5】、Nature protocols ^【6】和Cell ^【7】發表的四篇文章，整理了人類結直腸癌組織來源的類器官培養方案。

圖1. 病人組織來源的CRC類器官研究方案^【8】

細胞來源
切片樣本或手術樣本
培養基配方

組織處理
1. 將新鮮CRC組織樣本放入預冷的PBS中，剔除脂肪組織和壞死的腫瘤組織（通常為黃色或白色），只選取活的腫瘤組織（通常為粉紅色）。
2. 將CRC組織轉移到含有5 mL預冷的PBS溶液中清洗，並移除血液和碎片。為防止污染，需多次重複此步驟至液體變澄清。
3. 吸出PBS，將組織切割為1-2 mm³的小塊，此步驟可留存適量組織用於定序、免疫組化分析等。
4. 將剩餘組織塊切碎，並加入1 ml預冷的類器官培養基，用p1000吸頭將腫瘤碎片懸浮液轉移到含有5 ml解離培養基的離心管中，輕輕震盪混勻後，放置於37℃培養箱中解離1 h。每隔15min輕輕震盪或吹打混勻一次。
5. 加入8ml 預冷的DMEM/F12（含10%FBS）終止消化。
6. 將懸浮液經過70μm細胞篩網過濾，收集解離的細胞。
7. 將過濾的細胞懸浮液在4℃條件下450g離心5min。
8. 若細胞沉澱有明顯的紅色，則將細胞重懸於5ml的紅血球裂解液中，冰上孵育10min使紅血球裂解。
9. 將細胞懸浮液加入5ml DMEM/F12沖洗細胞一次，離心收集細胞沉澱後，加入1-2ml DMEM/F12重懸細胞，並進行台盼藍染色及細胞計數。
類器官培養
10. 將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，在冰上以3：1的體積比將Matrigel與細胞懸浮液混合，輕輕吹打混勻避免產生氣泡。
11. 從37℃培養箱中取出預熱的24孔板，將80μl混合液接種在各孔中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。
12. 將24孔板室溫放置5min後，轉移至37℃，5%CO ₂的培養箱中孵育10min，使Matrigel固化。
13. 在每個孔中緩慢滴加650μl 預熱的類器官培養基，確保基質膠被完全覆蓋。放於37℃，5%CO ₂的培養箱中培養，每2-3天更換培養基（用於換液的類器官培養基內不含Y27632)。
類器官繼代
14. 吸出類器官培養液，機械分離Matrigel，然後加入500μl胰蛋白酶，放置於37℃培養箱中孵育1-2min後，用移液器多次吹打，從基質膠中釋放類器官。
15. 以含有10%FBS的DMEM/F12培養基終止消化，在4℃條件下300g離心5min。
16. 用冷PBS清洗後，再次4℃條件下300g離心5min。
17. 將所得沉澱依1:3-1:5的比例重複10-13步驟（具體比例透過類器官的匯合度確定），完成繼代。
類器官凍存
18. 取1-2個孔的類器官，消化離心後取細胞沉澱，加入1ml細胞凍存液。
19. 將細胞重懸後轉移至凍存管中，利用程序降溫盒緩慢降溫至-80℃。
20. 第二天，將樣本轉移到液態氮中長期儲存。
類器官復甦
21. 將液態氮凍存的CRC類器官放置在37℃水浴鍋中解凍，水浴時間不宜超過2min。
22. 將細胞懸浮液轉移至15ml離心管中，加入10ml預冷的DMEM/F12培養基（含10% FBS）。4℃條件下300g離心5min，取細胞沉澱。
23. 將所得沉澱物重複10-13步驟，完成CRC類器官復甦。

圖2. 顯微鏡下CRC類器官的形態，以及Ki-67、E-Cadherin標記物的表達^【5】

利用類器官技術，能夠將CRC和正常結直腸組織在體外進行長期擴增，並且在微衛星穩定（MSS）來源的CRC類器官中發現，類器官模型能夠保留樣本的遺傳多樣性和形態穩定性^【9】。大腸直腸（癌症）類器官的進一步優勢包括可以進行建庫、細胞異質性研究、實驗動物移植、個別病患分析和基因編輯，目前已經成為了疾病建模的優秀工具，未來可能在再生醫學領域大放異彩^【10】。

圖3. 大腸直腸（癌）類器官在基礎與臨床研究的應用^【10】

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