近岸類器官課堂-卵巢癌類器官

Novoprotein 2022-06-22 13:09 發表於浙江

卵巢癌（Ovarian Cancer）是最具破壞性的婦科癌症，目前5年總存活率低至47% ^【1】。卵巢癌是一種高度異質性疾病，通常根據組織病理學、分子生物學和遺傳學分析的結果，將卵巢癌分為兩大類：I型卵巢癌病情進展緩慢，主要為低度漿液性癌症（LGSC），黏液癌，子宮內膜樣癌，透明細胞癌等；II型癌症則進展迅速，主要為高等級漿液性癌（HGSC）、未分化癌和癌細胞瘤。
治療卵巢癌的標準方式是手術切除和鉑-紫杉醇化療相結合，然而這類化療方式往往對於透明細胞癌和粘液癌患者無效【2,3】 ；此外，初始化療後通常會由於鉑^類耐藥而復發，因此建立更精準的卵巢癌模型對於深入理解疾病機制和個人化治療是必不可少的。基於類器官技術的OC類器官就是可以模擬來源組織關鍵特徵的體外模型，不僅能夠再現患者體內腫瘤的特異性（包括表型特性和基因突變），並且能夠檢測患者對藥物的敏感性。
本篇文章基於STAR Protocols ^【4】發表的文章，整理了病人組織來源的卵巢癌類器官的培養方案。

圖1. 病人組織來源的卵巢癌類器官培養方案^【5】

細胞來源
切片樣本或手術樣本
培養基配方

組織處理
1. 將取樣培養基中的組織轉移到培養皿中，並用PBS多次沖洗至液體變化澄清。然後用無菌手術刀剔除脂肪及壞死組織。
2. 將組織切割為1–2 mm³的小塊，此步驟可留存適量組織用於定序、免疫組化分析等。
3. 將所有剩餘的組織碎片收集到30 ml錐形管中，加入8 ml解離培養基，並在37°C條件下解離1-2h。每隔20min，利用移液器機械吹打，促進解離。
4. 向懸浮液中加入50μl脫氧核糖核酸酶（0.2mg / ml），並在20°C-22°C下孵育1min。
5. 加入8ml 預冷的DMEM/F12（含10%FBS）終止消化。
6. 將懸浮液經過70μm細胞篩網過濾，收集解離的細胞。
7. 將過濾的細胞懸浮液在4℃條件下220g離心5min。
8. 用1ml DMEM / F12（20°C-22°C）沖洗細胞一次，離心收集細胞沉澱後，加入500μl DMEM / F12（20°C-22°C）重懸細胞，並在細胞計數後，將細胞懸浮液調整濃度至1,500個細胞/μl。
類器官培養
9. 將凍存的Matrigel在4℃下過夜解凍，在冰上以7：3的體積比將Matrigel與細胞懸浮液混合，輕輕吹打混勻避免產生氣泡。
10. 從37℃培養箱取出預熱的48孔板，將20μl混合液接種在各孔中，注意需接種在孔的中心，避免接觸側壁。
11. 將48孔板倒置放入37℃，5%CO ₂的培養箱中孵育10min，使Matrigel固化。
12. 在每個孔中緩慢滴加250μl 預熱的OCO (Ovarian Cancer Organoid) 培養基，確保基質膠被完全覆蓋。放於37℃，5%CO ₂的培養箱中培養，每2-3天更換培養基（用於換液的OCO培養基內不含Y27632)。
類器官繼代
13. 當直徑達到約200-300μm時，將類器官依照1:3-1:5的比例進行繼代（具體比例透過類器官的匯合度確定）
14. 吸出孔內培養基，加入400μl預冷的DMEM/F12培養基，並用移液器多次吹打，從基質膠中釋放類器官。如果將多個孔合併，則將400μl培養基從第一個孔轉移到下一個孔（依此類推）。
15. 將收集的類器官轉移到1.5 ml Eppendorf管中並放在冰上，4℃條件下220g離心5min。
16. 去除離心上清，並加入37℃預熱的TrypLE Express（含10μM Y27632）。輕輕旋轉Eppendorf管，使類器官與TrypLE Express混合均勻。
17.  37℃條件下將類器官與TrypLE孵育10min（緻密型類器官）或5min（低黏滯性和囊性類器官）。
18. 加入500μl預冷的DMEM/F12終止消化，4℃條件下220g離心5min。
19. 將類器官沉澱重懸於700μl預冷的DMEM / F12中，使用移液管吹打數次，機械性破壞類器官。
20. 將所得細胞懸浮液重複8-12步驟，完成繼代。
類器官凍存
21. 取1-4個孔的類器官，消化離心後取細胞沉澱，加入1ml細胞凍存液。
22. 將細胞重懸後轉移至凍存管中，利用程序降溫盒緩慢降溫至-80℃。
23. 第二天，將樣本轉移到液態氮中長期儲存。
類器官復甦
24. 將液態氮凍存的OC類器官放置在37℃水浴鍋中解凍，水浴時間不宜超過2min。
25. 將細胞懸浮液轉移至15ml離心管中，加入10ml預冷的DMEM/F12培養基（含10% FBS）。4℃條件下220g離心5min，取細胞沉澱。
26. 將所得細胞重複8-12步驟，完成OC類器官復甦。

圖2. OC類器官的不同形態表型。即緻密（左），囊性（中）及低內聚（右）型OC類器官。比例尺200 μm ^【4】。

卵巢癌類器官樣本來源不限於切片樣本或手術樣本，腹水和胸腔積水的癌細胞也同樣可以用來建構OC類器官。培養成功的OC類器官經過DNA修復的功能性分析，可以準確預測病人對DNA修復抑制劑的臨床反應^【6】。同時，OC類器官也可以作為藥物篩選的模型，透過分析個別患者來源的OC類器官對化療藥物敏感性的差異，來預測患者對特定藥物的臨床反應，從而選擇針對患者的最佳治療方案^{【 7】}。透過建構病人來源的OC類器官，對於更深入了解卵巢癌的病因、發病機制、異質性和抗藥性至關重要，並且對於確定新的治療標靶和新藥研發、病人用藥決策方面都有著巨大的潛力。

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