近岸類器官課堂-您護肝，我養肝

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iPSCs培養與繼代
1.將100mm培養皿包覆5ml 0.1%（w/v）的明膠，室溫靜置15min至明膠凝固。
2.在明膠上接種絲裂黴素處理過的MEFs細胞懸浮液，細胞數約為1.8×10 ⁶個。放置在37℃，5%CO ₂的培養箱中培養至細胞匯合度70-80%時進行傳代。
3.吸去MEFs培養基，將iPSCs接種於明膠上，加入10ml iPSCs（I）培養基，放置於37℃，5%CO ₂的培養箱中培養3-5天。
定向內胚層分化
4.在60mm培養皿中加入2ml Matrigel，室溫靜置2h並加入DMEM-F12培養基至完全淹過Matrigel。
5. 用不含Ca ²⁺ /Mg ²⁺的PBS沖洗iPSCs後，加入300μl Accutase，37℃孵育3-4min。
6. 將消化下來的細胞懸浮液收集並90g離心5min，收集細胞沉澱並加入iPSCs（II）培養基，同時進行細胞計數。
7. 將iPSCs接種在Matrigel平板上，接種密度為1.5×10 ⁶個/60mm平皿，接種後加入4ml iPSCs（II）培養基，放置於37℃，5%CO ₂的培養箱中過夜培養。
8. 接種後第二天，以DEs培養基進行換液，放置在37℃，5%CO ₂的培養箱中培養6天，每2天換液一次。
肝內胚層分化
9. 以HEs培養基進行換液，放置於37℃，5%低氧的培養箱中培養3天。
10. 以HEs（II）培養基進行換液，放置在37℃，5%低氧的培養箱中培養4天，之後轉移至常氧條件下培養8天，達到肝臟成熟。
類器官培養
11. 肝成熟後的9-12天，在單層肝細胞上會出現三維結構，此時將漂浮的囊泡狀細胞收集起來，加入Matrigel並放置在37℃條件下10min使Matrigel凝固。
12. 添加HM培養基並完全沒過Matrigel頂部，每3天更換培養基，每7天機械繼代一次類器官。
類器官擴增和分化
13. 將HM培養基吸出，用PBS清洗後，加入EM培養基，放置於37℃，5%低氧的培養箱中培養4天進行類器官擴增。
14. 接著以DM培養基進行換液，放置在37℃，5%CO ₂的培養箱中培養6天，完成進一步分化。

圖2. 擴增培養基（EM）和分化培養基（DM）孵育後的肝類器官免疫螢光圖^【2】

肝類器官應用前景
類器官是一種能夠進行體外更新和自組裝的模型，相較於傳統的二維(2D)細胞培養，類器官的生長環境較貼合生理條件。3D培養的肝類器官可以用於疾病建模，以便確定疾病的機制以及治療方法。研究表明，3D培養的iPSC來源的肝類器官比2D幹細胞更易感染乙型肝炎病毒^【3】。2019年Ouchi, R.et al. ^【4】利用iPSCs來源的肝類器官，在體外模擬了發炎和纖維化，為進一步了解Wolman疾病打下了基礎。

在藥物毒性驗證方面，肝類器官同樣扮演重要的角色。對乙醯氨基酚是藥物引起肝衰竭最常見的來源，利用肝臟類器官可以實現藥物的肝毒性驗證，更適用於未來的藥物篩選和開發^{【5 】}。