近岸類器官課堂-會呼吸的類器官

圖1. hPSCs來源的芽尖祖細胞類器官或hLOs培養方案^【2】

細胞來源
hPSCs
培養基配方

hPSCs培養與繼代
1.將凍存的Matrigel在4°C下過夜解凍，在6孔板的每孔滴加1ml冷的Matrigel，旋動6孔板使Matrigel溶液分佈均勻。接著轉移至37℃條件下培養10min使其凝固，使用前需室溫靜置1h。
2.將hPSCs接種在包被Matrigel的6孔板中，每孔加入3ml mTeSR1，放置在37℃，5%CO ₂的培養箱中，培養至細胞匯合度約75-85%、且大部分無分化的狀態時，吸出培養基。
3.向hPSCs中加入1 ml Dispase（1mg/ml），並將培養皿放置在37℃條件下進行解離約5-10min，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式漂浮。
4.在每個孔中加入5ml的DMEM-F12，以充分稀釋Dispase。
5.將所有細胞轉移至離心管中，室溫下300g離心3min，收集沉澱細胞。加入DMEM-F12培養基，以1:6的比例接種在Matrigel包被的24孔培養板中，向每個孔中加入0.5ml預熱的mTeSR1進行培養，至細胞匯合度達45-75%。
定向分化為內胚層及前腸球體
6.將24孔板內的mTeSR1每天依照上表中第1-4天內胚層分化培養基組分進行換液，並將平板放回37℃，5%CO 2的培養箱_中。
7.吸出第4天內胚層分化培養基，替換為每孔0.5ml預熱的前腸內胚層分化培養基，並將平板放回37℃，5%CO 2的培養箱_中。第5-9天，每天更換培養基。培養至第8-9天左右會形成分離的、漂浮的球狀體。
收集漂浮的前腸球體
漂浮前腸球體的收集通常在配有體式顯微鏡的層流罩或半無菌罩中進行，整個過程中需確保無菌技術和無菌環境。
8.將含有前腸球體的24孔培養板置於顯微鏡下。在不破壞單層細胞的情況下，用移液管吸頭輕輕移出自由漂浮的球體，並將其轉移到1.5ml的離心管中。讓球狀體在離心管底部沉澱5-10 min，必要情況下可用微量離心機以低速離心10s。
9.將吸出的球體接種於200μl 含蛋白濃度8.0mg/ml的Matrigel膠中，輕輕吹打混勻，迅速操作並防止氣泡產生。
10.在24孔板的每個培養孔中心接種25μl 混合液，放入37℃培養箱靜置10min。待Matrigel凝固後，加入0.5ml hLOs培養基或芽尖祖細胞類器官培養基進行培養。
A、培養hLOs
11A.在各孔中加入0.5ml hLOs培養基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
12A.如果類器官出現腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。13A.用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養基一同吸出，並放置於顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。隨後將新的類器官轉移至1.5ml離心管中，並吸去所有培養基。
14A.向離心管中添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻後在24孔板的每個培養孔中心接種50μl 混合液，目的是在每個孔內植入1-3個類器官。待Matrigel在37℃培養箱靜置10min凝固後，加入0.5ml hLOs培養基進行培養。
15A.每2-3週重複步驟12A-14A。一旦前腸球體被置於Matrigel中，大約需要50天可以形成具有基底細胞、黏液分泌細胞、纖毛細胞，以及肺間質細胞類型和原始肺泡細胞類型包圍的假複層上皮結構。隨著時間的推移，培養60-85天的類器官狀態最佳。
B、生成芽尖祖細胞
11B.在各孔中加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
12B.如果類器官出現腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
13B.用移液管將Matrigel液滴和周圍的培養基一同吸出，並放置於顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。
14B.隨後將新的類器官轉移至1.5ml離心管中，高速（約6000g）離心3-5s，或低速（約300g）離心3min。離心後，上皮碎片將沉降到底部，Matrigel繼續懸浮在培養基中，細胞團沉積在離心管底部。
15B.在顯微鏡下用移液器取出培養基和Matrigel，向沉澱的細胞團內添加200μl新鮮的Matrigel，混合均勻後在24孔板的每個培養孔中心接種25μl 混合液。待Matrigel在37℃培養箱靜置10min凝固後，加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基培養。
16B.每2-3天依照步驟12B-15B進行繼代。
培養芽尖祖細胞類器官
17B.芽尖祖細胞培養約2週後，會形成一個幾乎均質的芽尖祖細胞群。在各孔中加入0.5ml人類芽尖祖細胞類器官培養基，確保完全覆蓋Matrigel液滴。每3-5天換液一次。
18B.如果類器官出現腔中積攢了細胞碎片，或下沉到Matrigel的底部，則用移液管輕輕刮培養孔底部，以解離含有類器官的Matrigel。
19B.用移液器將Matrigel液滴和周圍的培養基一同吸出，並放置於顯微鏡下，輕輕去除舊的Matrigel，小心不要切到組織。隨後將新的類器官轉移至1.5ml離心管中，並吸去所有培養基。
20B.在離心管中加入200μl新鮮的Matrigel，混合均勻後在24孔板的每個培養孔中心接種50μl 混合液。待Matrigel在37℃培養箱靜置10min凝固後，加入0.5ml人芽尖祖細胞類器官培養基培養。
由於含有芽尖祖細胞，在類器官周圍的芽尖內部會出現SOX2+氣道狀結構，可分化為黏液分泌細胞。黏液和細胞碎片通常會聚集在類器官的腔中，因此需要在顯微鏡下將這些光學緻密、顆粒狀的雜質去除。
21B.將Matrigel轉移至預熱的DMEM-F12培養皿中，用無菌手術刀將類器官切成兩半。取1ml注射器吸滿DMEM-F12，輕輕推出培養基，沖洗類器官中的黏液等雜質。

圖2.hLOs和芽尖祖細胞類器官的生長模式^【2】
hLOs主要由肺的上皮和間葉部分組成，其結構特徵與天然肺相似。利用RNA定序，Dye, BRet al. ^【3】發現hLOs與人類胚胎肺在全球轉錄譜上非常相似，這表明hLOs是研究人類肺部發育、成熟和疾病的一個極好的模型。

圖3. hLOs和人類胚胎肺的相關性很高^【3】