近岸類器官課堂-我是養胃小能手

胃是一個肌肉器官，在食物儲存和消化中扮演重要角色。人的胃包含兩個主要區域:包含胃底（fundic）上皮的胃體（corpus）和胃竇（antrum）。每一個區域都有不同的細胞類型和功能，因此都可以作為獨特的發育和疾病研究對象。
人源胃類器官（hGOs）的培養像傳統的2D細胞培養一樣，可以進行傳代、冷凍和復甦；並且在長期維持基因組穩定性的同時，可以保留原始組織的特徵。因此，建構胃類器官可以回答從基礎科學到臨床轉化的各種問題。我們可以利用這個工具，模擬體內的器官發育、也可以用來研究幽門螺旋桿菌感染機制。此外，利用CRISPR/Cas9技術已成功實現類器官的疾病建模，人類正在使用此模型，揭開胃部疾病的神秘面紗。
體外3D培養胃類器官的步驟較為複雜，小編在此整理hPSCs來源的細胞分離及胃類器官培養、擴增的步驟，改編自BRODA等人所描述的方法【1 ^】。

圖1. 人胃的結構，以及由胃底（fundic）和胃竇（antrum）構成的類器官hFGOs和hAGOs ^【2】
所需試劑：
表1. hGOs培養所需的培養基




hPSCs細胞消化並傳代
1.將hPSCs培養至融合度約75–85%，且大部分無分化的狀態時，吸出培養基。
2.在每個孔中加入1 ml Accutase，並將培養皿放回37℃，5% CO ₂的組織培養箱中，直到所有的細胞都以小細胞塊或單細胞的形式解離並漂浮(通常需要7-10分鐘)。
3.在每個孔中加入5ml的DMEM/F12，以充分稀釋Accutase。
4.將所有細胞轉移至離心管中，室溫下300g離心3min。
5.吸出上清，並進行細胞計數，同時在24孔板的每孔滴加500 μl冷的Matrigel，室溫靜置使其凝固。
6.以300,000 ± 50,000個細胞/孔的數量接種在已包被Matrigel的24孔板中，每孔加入500μl mTeSR1（含有10 μM ROCK inhibitor Y-27632）。
7.將24孔板放置在37℃，5% CO ₂的組織培養箱中培養24h。
8.在顯微鏡下觀察狀態，當單層的hPSCs融合度達到75-90%時，記為第0天。
hPSCs分化為人類DE（第0-2天）
9.吸出mTeSR1培養基，加入DE生成培養基繼續培養48h，每24h換液一次（依照表格中的時間節點進行配製）。在分化過程的第一天和第二天，可以觀察到大量漂浮的細胞碎片，但仍具有連接細胞的網狀結構。
10.分化第二天後，單層細胞融合度可達95–100%。
後前腸球狀體的自發芽（第3-5天）
11.吸出培養基，加入球狀體生成培養基繼續培養48h，每24h換液一次（依照表格中的時間節點進行配製）。
12.在第4天可以看到在孔表面有明顯的球體生成前的3D結構。
13.由於第5天的培養基中有添加RA，因此需要關閉生物安全櫃的燈，並用錫箔紙包裹培養基和RA管，以防止過度曝光。此時可以觀察到有大量出芽結構的3D球體，和少量漂浮的球狀細胞團。
14.第6天，可以觀察到培養基中漂浮著大量的後前腸球狀體。
15.在顯微鏡下小心地吸出後前腸球狀體，並收集到微量離心管中。
球狀體發育成hAGOs或hFGOs(第6-20天)
16.4℃條件下過夜解凍Matrigel。
17.將裝有後前腸球狀體的微量離心管直立放置在管架上約5min，利用重力將球狀體沉澱在底部，此時不需要離心。
18.盡可能去除上層培養基，將350 μl冷的Matrigel快速加入到含有球狀體的微量離心管中，快速吹打混勻，注意避免引入氣泡。
19.吸取50 μl懸浮液，接種到24孔板的孔中心。保持移液管吸頭稍微高出孔底，並確保移液時不會接觸孔壁。
20.將培養皿放入組織培養箱中孵育10-15min，使Matrigel完全固化。然後在每個孔中添加500 μl hGOs形成培養基，確保每個孔中的Matrigel都被培養基覆蓋。
21.當培養基中的酚紅變黃，或當培養方案要求改變生長因子時（以先發生者為準），每4天更換一次hGOs形成培養基，直到第20天。
hGOs繼代以實現持續成長
22.在第20天左右，透過將hGOs重新包埋在新鮮的Matrigel中，來降低每個孔中hGOs的密度。
23.在顯微鏡下觀察肺類器官，為了確保最佳生長狀態，每個孔洞應包含約500 個類器官。
24.吸出孔內的培養基，加入少量DMEM/F12培養基。
25.在立體顯微鏡下，使用解剖刀將嵌入hGOs的Matrigel切割成薄片，每個切片包含五到十個hGOs。盡量避免直接切割hGOs，而是切割周圍的Matrigel，當然大多數被切割的hGOs會重新形成完整的內腔並繼續生長。
26.重複步驟16-21進行hGOs繼代培養。
成功培養出的hGOs可以作為研究胃生理學、胃疾病生理學和藥物開發的有力模型。