一文詳解: CAR-T研發生產全流程解決方案

CAR-T簡介
CAR-T細胞治療：又稱為嵌合抗原受體T細胞治療，是將人類的T細胞經過基因工程手段體外修飾改造後，回輸患者體內。改造後的T細胞，可辨識體內腫瘤細胞，並透過免疫作用釋放大量的多種效應因數，它們能高效地殺死腫瘤細胞，從而達到治療惡性腫瘤的目的。
對T細胞的改造主要是進行CAR分子的「安裝」。CAR（嵌合抗原受體）是T細胞受體（TCR）與抗原辨識域，如單株抗體的單股片段（scFv）融合的嵌合分子。與TCR介導的抗原辨識相比，CAR的抗原辨識並不依賴主要的組織相容性複合體（MHC），而改造成功的CAR-T細胞可直接透過CAR分子辨識出特異性抗原。

CAR-T細胞治療生產全流程
CAR-T細胞治療全流程，包括採集病患或健康捐贈者的周邊血單核細胞（PBMC）、T細胞分離啟動，T細胞體外基因修飾，CAR-T細胞體外擴增，CAR-T細胞質量監控，CAR-T細胞回輸患者體內這六個主要步驟。

圖1 CAR-T細胞治療工作流程的示意圖^[1]

T細胞的分離、活化
CAR-T細胞的產生始於透過單採或週邊靜脈血收集患者的周邊血單核細胞（PBMC）。由於PBMC的組成差異很大，為確保盡量獲得一致的CART細胞，需要利用以磁珠為基礎的技術分離出特定的T細胞亞群，如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T細胞。
許多研究表明，T細胞亞群的選擇是CAR-T細胞治療效果的基礎。在這方面，中央記憶T細胞（TCM）的CAR轉導似乎對體內有效的細胞擴張、存活和持久性至關重要^[2]。此外，選擇幼稚或分化程度較低的CD8+ T細胞進行轉導可以使輸注後T細胞增生和體內持久性增加。

無論是否採用了T細胞分離過程，都需要T細胞活化步驟來進行充分的轉導與擴增。為了實現這一目標，使用可溶性抗CD3抗體或固定化的CD3和CD28抗體刺激活化T細胞。固定化的抗CD3抗體提供更好的T細胞交聯和活化，而CD28抗體可活化目標細胞中的共刺激途徑。

圖2 抗CD3/CD28抗體活化T細胞原理示意圖

Novoprotein提供GMP級重組CD3/CD28抗體以及GMP級CD3/CD28磁珠，磁珠可以為T細胞黏附提供更大的比表面積，因而達到更好的T細胞刺激活化的效果。

T細胞改造
(1) T細胞基因修飾方法
對T細胞進行體外基因修飾，常用的方法包括使用攜帶編碼CAR受體序列的病毒載體，轉座子，透過奈米顆粒、脂質體、電穿孔介導的mRNA轉染方法或CRISPR/Cas9技術方法來實現T細胞的基因修飾。
A、mRNA用於T細胞的基因修飾：
新冠引爆的mRNA技術近幾年得到了快速發展，除了在傳染病疫苗領域的用途，mRNA技術在腫瘤治療領域也逐漸凸顯其優勢。透過體外轉錄修飾獲得的轉座子及CRISPR/Cas9系統等mRNA，已成功用於T細胞基因編輯。
Novoprotein提供全套mRNA體外轉錄及修飾用酵素及試劑，產品符合GMP級生產及品質管理體系，已協助多家企業mRNA疫苗進入臨床階段。產品透過FDA DMF備案，為客戶中美雙報打下基礎。除酵素原料產品外，Novoprotein也提供自序列設計開始至LNP包裹的全流程CRO服務，為mRNA技術平臺初建客戶提供快速解決方案。
B、CRISPR/Cas9技術用於T細胞的基因修飾
利用CRISPR/Cas9系統同時破壞多個基因位點，產生的TCR（T cell receptor）和HLA-I（HLA class I）缺陷的CAR-T細胞可以減少移植物抗宿主疾病（GVHD）和免疫排斥反應的發生，在開發通用型CAR-T細胞中已被廣泛應用。CRISPR/Cas9敲除αβ T細胞內源性的TCR製備的通用型CAR-T細胞在臨床前已經取得了很好的治療效果[3] 。除了產生通用的CAR-T細胞，CRISPR-Cas9技術也可以透過敲除編碼訊號分子的基因如PD1和CTLA4或編碼T細胞抑制性受體的基因來提高CAR-T細胞的功能。

圖3 CRISPR/Cas9作用原理示意圖
Novoprotein可以提供GMP級的Cas9蛋白
產品特點：

1. 無重金屬殘留，無抗性殘留
2. 無菌、無抗生素、無病原體、無支原體
3.  高純度、高活性（體內外雙重驗證）
4. 內毒素低於10EU/mg、宿主蛋白殘留量低於0.005%、外源性DNA殘留量低於100pg/mg
5. 高穩定性和批間一致性
6. GMP廠房生產、藥典標準放行檢測

產品數據：
（1）293T細胞Cas9蛋白切割效率比較 

（2）T7EI切割效率檢測

lane1：marker；lane2：Novoprotein的切割效率為50.9%; lane3：對比品牌B的切割效率為33.4%; lane4：對比品牌A的切割效率為46.2%。lane5：陰性對照（目標基因片段+T7EI）；lane6：陰性對照（目標基因片段） 
(3) 病毒載體的大規模生產
目前已有幾種成熟的基因轉殖平臺，可用於將嵌合抗原受體（CAR）基因引入原代T細胞。轉基因插入可以透過病毒介導的轉導、mRNA轉染，睡美人轉座子、piggyBac轉座子或質粒DNA的非病毒轉染來進行。在臨床基因轉殖應用中，病毒載體是在標靶細胞中實現感興趣基因永久穩定表現或基因表現突變的主要手段。

圖4 rAAV病毒載體生產流程示意圖
圖片參考來源：Mcclure C , Cole K , Wulff P , et al. Production and Titering of Recombinant Adeno-associated Viral Vectors[J]. J Vis Exp, 2011(57).

在病毒載體的大規模生產純化過程中，核酸殘留成為各類質控標準的重中之重，因為DNA較好的穩定性，容易在生產過程中形成殘留，而最終的生物製品應用到人類疾病預防和治療時，會帶來不可控的危險因數。對於病毒載體在生產過程中產生的核酸，現在大多選擇核酸酶來去除。
Novoprotein質提供GMP條件下生產的全能核酸酶（BenzoNuclease），無動物源性, 無氨芐青黴素，可高效降解單鏈、雙鏈、線性、環狀、超螺旋等任何形式的DNA及RNA。品質、性能、供貨能力可靠，並已完成在美國FDA的藥物主檔（Drug Master File, DMF）申報備案，可滿足藥物申報的規範。同時提供高性能配套全能核酸酶殘留檢測試劑盒（檢測範圍0.014-10ng/ml），靈敏度高。

CAR-T細胞擴增
不管是原代T細胞還是通過基因修飾獲得的CAR-T細胞，都需要進行大規模的體外擴增，才能獲得達到後續環節以及治療所需劑量。已有大量文獻指出，細胞因數IL-2/IL-7/IL-15在T細胞增殖、T細胞亞群的生長以及提高CAR-T產品療效和持久性方面發揮重要作用。
Hopkins B等人進行了一項實驗設計，研究不同組合IL-2、IL-7、IL-15對T細胞亞群生長的影響。結果表明，CD4+和CD8+ naïve T細胞分別在中等濃度的IL-2和IL-7組合以及IL-7作用下可以有效生長。CD4+和CD8+記憶細胞分別在中等濃度IL-2和IL-15組合以及中等濃度IL-7和IL-15組合中有利^[3]。Coppola C等研究結果表明IL-2和IL-7在促進活化的CD4+ T細胞的最佳增殖和存活方面存在協同作用^[4]。
Novoprotein提供GMP級IL-2/IL-7/IL-15細胞因數產品，且已通過FDA DMF備案。如果您使用了Novoprotein的DMF備案系列產品並需要引用DMF編號，點擊下方按鈕提出授權申請，我們收到申請後，將向FDA提供DMF授權書。點擊申請授權

產品資料展示（以Recombinant human IL-7為例）：
（1）活性數據

Measured in a cell proliferation assay using PHA-activated human peripheral blood lymphocytes (PBL). The ED50 for this effect is 168.10 pg/ml.The specific activity of Recombinant human IL-7 is > 1.0 × 108 IU/mg, which is calibrated against human IL-7 WHO International Standard (NIBSC code: 90/530)
（2）批間穩定性資料

Recombinant human IL-7 stimulates proliferation of PHA-activated human peripheral blood lymphocytes.The ED50 for this effect is 168.10 pg/ml.The specific activity is > 1.0 × 108 IU/mg.Three independent lots were tested for activity and plotted on the same graph to show lot-to-lot consistency of IL-7.

CAR-T細胞質量監控
目前，細胞治療產品的品質控制分為四個大的方面，分別為安全性、純度、效力以及均一性，這些品質控制會貫穿CAR-T生產的各個階段。

其中CAR-T的均一性和純度主要指目標細胞（CAR陽性T細胞）所占的比例。目前有針對CAR不同結構區域的檢測方法，包括針對CAR抗原結合位點的（如CD19抗原或抗scFv抗體），和針對輕鏈或鉸鏈區的（如抗Fab抗體或Protein L）。
Novoprotein提供CARTEST^® CD19檢測試劑盒可用於CAR陽性率檢測。CARTEST CD19可與CAR-T細胞表面anti-CD19 ScFv 特異結合，再與螢光標記的Fc抗體孵育，借助流式細胞儀即可檢測CAR-T細胞的比例。此方法利用抗原-抗體特異性反應，可有效降低使用Protein L檢測ScFv存在假陽性率高的問題，使得資料更加真實可靠。

CARTEST^® CD19檢測試劑盒檢測anti-CD19 CAR-CHO cells陽性率