從核苷修飾說起，帶你瞭解mRNA修飾的奧秘

mRNA技術的應用領域非常廣泛，目前主要用於傳染性疾病疫苗、腫瘤免疫治療、蛋白質替代療法和基因編輯等方面，尤其在腫瘤免疫治療和傳染性疾病疫苗的應用上較為突出。公開數據顯示，全球有超過150個mRNA疫苗藥物項目正在推進，明確核准及進入臨床階段的也有近百個，其中約70%為感染性疫苗項目，約30%為腫瘤治療性疫苗項目。

諾貝爾生理學/醫學獎授予了美國科學家卡塔林·卡裡科和德魯·魏斯曼，以表彰他們「他們發現了核苷鹼基修飾，從而開發出有效的新冠肺炎mRNA疫苗」。本文總結了mRNA的其他更多重要修飾。

圖1. mRNA疫苗的作用機制（Wadhwa A  et al.  2020）

體外合成mRNA的修飾
1. 5′端加帽
RNA聚合酶催化RNA的轉錄合成，此過程以DNA為範本；RNA聚合酶作用於DNA範本鏈的3'端，RNA鏈從5'端延伸至3'端。轉錄的同時，mRNA的5'端進行加帽反應，7-甲基鳥嘌呤透過5'-5'三磷酸鍵與mRNA的5'端連接。依甲基化修飾的程度不同分為3種帽結構：Cap0、Cap1和Cap2（圖3）。

圖2. 5'端加帽mRNA的結構，cap0, cap1, cap2結構和5'ppp5'結構，對應的甲基化位置以箭頭指示（Chen Y  et al . 2016）

體外合成的RNA需要透過一定的合成過程完成5'端帽結構的添加，以形成完整的mRNA結構。mRNA的完整性確保了蛋白質的準確翻譯，5'-Cap帽結構修飾可以保護mRNA免受5'-外切酶活性降解、有效促進翻譯的起始、降低免疫原性。常用的加帽製程有兩類，一類是在IVT結束後，透過牛痘病毒加帽酶和2'-O-甲基轉移酶的共同作用，完成Cap1的修飾；一類是在IVT過程中，透過在體系內引入帽類似物，完成帽結構的修飾。兩種方式在工藝、結果以及智慧財產權壁壘等方面各不相同。

圖3. 酵素法加帽與共轉錄加帽的比較，圖片引用於Novoprotein Scientific Inc.

酵素法加帽過程：在RNA三磷酸酶作用下，mRNA 5'端γ-磷酸基團被移除，生成5'-二磷酸RNA；在鳥苷酸轉移酶（guanylyl-transferase）作用下，GTP中的GMP基團與5'-二磷酸RNA連接；在鳥嘌呤N-7甲基轉移酶（guanine-N(7)-methyltransferase）作用下，鳥嘌呤的N7位發生甲基化（甲基供體為S-腺苷甲硫胺酸[SAM]），形成帽結構Cap0（m7GpppNpNp）。而後在2'-O核糖甲基轉移酶（2' -O Ribose methyltransferase）作用下，mRNA第一個核苷酸的2'-O位發生甲基化，形成帽結構Cap1（m7Gpppm2'NpNp）； mRNA第一個和第二個核苷酸的2'-O位均發生甲基化，形成帽結構Cap2（m7Gpppm2'Npm2'Np）（圖5）。

圖4. 真核生物mRNA中酵素5 '端帽形成的示意圖（Muttach F  et al . 2017 ）

Novoprotein提供mRNA加帽過程中所需的2種加帽酶:牛痘病毒加帽酶（目錄編號：GMP-M062、M062）和mRNA Cap2'-O-甲基轉移酶（目錄編號：GMP- M072、M072）及完整試劑盒（目錄編號：M082）。

2. 3′-端加尾
體外合成mRNA的加尾方式主要有兩種：(A)以Poly(A) Polymerase酶促方式加尾；(B)在範本上引入編碼PolyA的序列（圖6）。PolyA尾與透過核膜有關，也可防止核酸外切酶降解。這種多聚腺苷酸尾巴很重要，它的長度決定了mRNA在細胞中的存在時間，以及細胞利用mRNA表達蛋白的頻率。這種多聚腺苷酸尾巴也是mRNA從細胞核遷移出去所必需的。早期基於實驗證據的假說認為，Poly(A)尾與胞漿中的多聚腺苷結合蛋白（PABPC）促進翻譯並阻止mRNA降解（decay），但具體機制並不清楚。最近對Poly(A)尾的作用認識更為豐富：Poly(A)結合蛋白可以促進Poly(A)的去除（即脫腺苷化，deadenylation），而當mRNA穩定且高頻翻譯時，Poly( A)在穩態下的長度遠低於預期。此外，翻譯延伸的速率會影響脫腺苷化。因此，Poly(A)尾、PABPC、翻譯過程和mRNA降解間的相互作用在基因調控中扮演重要角色。

圖5. 2種加尾法：(A)轉錄後酵素加尾；(B)用Bsal 將範本線性化後進行轉錄

Novoprotein提供mRNA加尾過程種所需的加尾酶 E. coli  Poly(A) Polymerase（目錄編號：GMP-M012、M012）。

3. 化學修飾
mRNA中還存在很多化學修飾，有堿基的修飾，也有核糖的修飾。這些修飾可以參與mRNA的剪接、核輸出、轉錄本穩定性和翻譯起始等事件，進而調控多種生理及病理過程。迄今為止共鑒定出超過170種RNA化學修飾，mRNA中常見的修飾包括N6-甲基腺苷（N6-Methyl-Adenosine，m6A），5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，m5C），N1-甲基腺苷（N1-methyladenosine ，m1A)，N7-甲基鳥苷（N7-methylguanosine ，m7G)，N4-乙醯胞嘧啶（N4-acetylcytosine，ac4C)，假尿苷（Ψ），肌苷（I）和核糖甲基化（2'-O-Me），5-甲氧基-尿苷（5-Methoxy-Uridine，5moU）等。其中m6A最為普遍，研究也較多（圖7）。

圖6. 真核生物mRNA的化學修飾成分（Cui L et al. 2022）

圖7. 化學修飾在mRNA中的位置（Cui L et al. 2022）

採用修飾核苷酸合成的mRNA可以通過體外轉錄技術經濟高效地大規模生產，並且可以在細胞質中快速暫態表達，而不會有整合到基因組中的風險。然而，未修飾的合成mRNA不穩定並刺激細胞先天免疫的啟動。由於環境RNA酶的高活性，未修飾的合成mRNA在很大程度上存在降解問題。進入細胞後，未修飾的RNA分子會被多種信號受體識別，例如內體Toll樣受體、細胞質蛋白激酶R、2′-5′-寡腺苷酸合成酶（OAS）、視黃酸誘導基因I（RIG-I）或黑色素瘤分化相關基因5（MDA5），並誘導I型干擾素、白細胞介素-6和其他促炎細胞因數的產生，從而刺激細胞先天免疫的啟動。

修飾核苷酸主要是通過阻礙信號受體識別mRNA，避免下游信號通路的啟動從而逃避先天免疫反應。Ψ通過阻礙TLR7/8、PKR、OAS和RIG-I介導的信號通路的刺激來降低細胞內先天免疫原性。值得強調的是，這些細胞受體不僅能感知某些修飾的存在與否，還能感知RNA鏈特徵（單鏈或雙鏈RNA）以及堿基修飾的位置和組合。m5C通過阻止TLR7/8，PKR和RIG-1介導的信號通路的的刺激來降低細胞內先天免疫原性，並穩定mRNA，從而延長半衰期。m6A修飾可降低TLR3/7/8、PKR、MDA5、OAS和RIG-I與mRNA的結合，從而逃避先天免疫。

Novoprotein mRNA技術-原料/服務一站式解決方案提供包括T7 High Yield RNA Transcription kit (E131) 在內的RNA體外轉錄所需的多種原料酶和相關輔助試劑，可以滿足廣大研究者多方面的生產和實驗需求。

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參考文獻
1. Wadhwa A, Aljabbari A, Lokras A, Foged C, Thakur A. (2020) Opportunities and Challenges in the Delivery of mRNA-based Vaccines. Pharmaceutics. Jan 28;12(2):102.
2. Chen Y, Guo D. (2016) Molecular mechanisms of coronavirus RNA capping and methylation. Virol Sin. Feb;31(1):3-11.
3. Muttach F, Muthmann N, Rentmeister A. (2017) Synthetic mRNA capping. Beilstein J Org Chem. Dec 20;13:2819-2832.
4. Cui L, Ma R, Cai J, Guo C, Chen Z, Yao L, Wang Y, Fan R, Wang X, Shi Y. (2022) RNA modifications: importance in immune cell biology and related diseases. Signal Transduct Target Ther . Sep 22;7(1):334.